pBackZero-T Vector Cloning Kit

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■ 制品内容

pBackZero-T Vector (50 ng/μl)   20 μl × 1 支
Control Insert 4 (50 ng/μl) 10 μl × 1 支
Solution I*1   75 μl × 2 支
Primer Bla M1 (20 μM)*2 50 μl × 1 支
Primer Bla RV (20 μM)*2 50 μl × 1 支

*1：使用时请于冰中融解。
*2：Primer Bla M1：5’- AAG CCC TCC CGT ATC GTA GTT ATC -3’ (24 nt)
Primer Bla RV：5’- ACT CAC GTT AAG GGA TTT TGG TCA -3’ (24 nt)

■ 制品说明
pBackZero-T Vector是一种阳性克隆率非常高而背景很低的PCR产物克隆 (TA Cloning) 专用载体。本载体是由pUC19载体改建而成，它消除了pUC19载体上的LacZ基因及多克隆位点，并对β-lactamase (bla) 基因进行了特别的改造，再通过酶切反应，最后在两侧的3’端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
本载体对β-lactamase基因进行了特别的改造，使用时需在待插入的DNA片段的上、下游Primer的5’端加上TTTAA 5个碱基。如果需要进行定向克隆，只需在一条引物的5’端加上TTTAA 5个碱基，这样可以保障β-lactamase基因具有活性，菌落可以在Amp抗性平板上生长。而那些由于载体自连、插入非目的片段等原因造成的假阳性克隆不具有β-lactamase基因活性，不能在Amp抗性平板 (工作浓度100 μg/ml) 上生长。因此使用这种载体在Amp抗性平板上生长的菌落基本都是阳性克隆，背景降至很低，保证了非常高的阳性克隆率。使用本试剂盒中的Control Insert 4时，阳性克隆率可以达到99%以上。此外，本载体也无需使用IPTG/X-Gal进行蓝白筛选。值得注意的是由于本载体上消除了多克隆酶切位点，当PCR产物使用本载体进行克隆时，将无法使用载体上的限制酶切位点，需要事先在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。本制品中的高效连接液Solution I可以在短时间内(约30分钟)完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。本制品中的Control Insert 4 (500 bp) 可以用于Control反应。

■ 保存
-20℃。

■ 纯度
Control Insert 4经克隆后，有99%以上含有Insert DNA片段。

■ 用途
1. 进行TA克隆，克隆PCR产物。
2. 低背景需求的克隆。
3. 对克隆后的DNA进行测序。
4. 定向克隆。

■ pBackZero-T Vector的结构

■ 使用事项

1. PCR片段扩增用的2条Primer除了含有扩增目的片段用的序列外，还要在其5’端均加入TTTAA 5个碱基。当进行定向克隆时，可以选择其中1条Primer加入TTTAA 5个碱基。
2. Solution I请于冰中融解。
3. 克隆时使用的Insert DNA片段(PCR产物)建议进行切胶回收纯化，否则PCR产物中的短片段DNA(甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段)、残存引物等杂质都会影响TA克隆效率。
4. 按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过20 μl。当要转化的DNA量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀，纯化DNA后再进行转化。进行乙醇沉淀时使用Dr. GenTLE Precipitation Carrier (Code No. : 9094) 可以提高DNA的回收率。
5. 连接反应请在25℃以下进行，温度升高 (>26℃) 较难形成环状DNA。连接效率偏低时，可适当延长连接反应时间至数小时。
6. 本制品来源于pUC19载体，因此，适合pUC19载体的感受态细胞都可以使用，如：JM109等。
7. 由于本制品是利用β-lactamase缺失进行筛选，所以对筛选平板使用的氨苄青霉素 (Amp) 的质量要求较高，请使用高品质的氨苄青霉素 (Amp) ，工作浓度为100 μg/ml。不要使用配制时间过长的氨苄青霉素 (Amp) 或平板。

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