88Click EdU-594细胞增殖检测试剂盒 E2052
描述：
目前检测细胞增殖的方法大多利用细胞产生的一些代谢酶类，来间接评定细胞的增殖活性（如CCK-8法、MTT法等），但一些药物或细胞本身状态等因素会对评定的结果造成一定影响。直接检测细胞中DNA合成，来判断细胞的增殖是公认的最精确且有效的检测方法。
EdU（5-Ethynyl-2'- deoxyuridine，5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷）是一种含有一个乙炔基团的胸腺嘧啶脱氧核苷类似物，当将其注射到动物体内或者对体外培养的细胞进行孵育，这些小分子能够迅速扩散到各个器官组织，并渗入到细胞中，可以在细胞增殖时期代替胸苷（T）掺入到新合成的DNA中。EdU分子中的乙炔基团能与荧光标记的叠氮化合物探针在铜离子催化下发生“点击”反应形成稳定的三唑环，因此可以使新合成的DNA被相应的荧光探针所标记。EdU检测法同放射性标记核苷掺入法相比，没有放射性污染等限制因素；同BrdU检测法相比，EdU检测法不需要DNA的变性处理，也不用抗原抗体反应，大大减少了实验的复杂性和时间，也使其变得更省时、更灵敏、更稳定和更准确。本试剂盒可用于检测体外培养的细胞或动物组织中细胞增殖情况。试剂盒中荧光探针为红色荧光，最大激发波长为593 nm，最大发射波长为614 nm，处于增殖的细胞被标记后，细胞核会显示出明亮的红色荧光，通过配套常规细胞核染料共同标记细胞核（试剂盒提供Hoechst 33342细胞核染料），可用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等仪器直接观察细胞增殖情况；也可以使用流式细胞仪检测体外培养细胞群荧光强度，根据荧光强度，来判断细胞周期中S期的DNA复制活性。
组成：
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EdU储存液（10 mM）
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100 μL
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-20℃
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催化试剂（试剂A）
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120 μL
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4℃
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荧光染料iF594（试剂B）
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50 μL
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-20℃
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催化添加剂（试剂C）
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2×100 mg（powder）
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-20℃
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反应缓冲液
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20 mL
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4℃
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Hoechst 33342染色液
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30 μL
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-20℃
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操作步骤：
1.体外细胞样品以及试剂准备工作：
1.1.将细胞按一定密度均匀种植于细胞培养板中（种植密度，由细胞大小、生长快慢等因素决定），待细胞贴壁或恢复正常状态后，进行相应的药物刺激等处理（如检测悬浮细胞，请按悬浮细胞常规操作方式进行，整体实验均需添加离心等步骤）。
1.2.催化添加剂（试剂C）低速离心，加入1mL超纯水溶解，并分装后于-20℃存放备用。
2.体外细胞EdU标记、固定及通透：
2.1.配制2×EdU孵育工作液：每1mL完全细胞培养基中加入2μLEdU存储液（10 mM），即为20μM的2×EdU孵育工作液，并放入培养箱中预热（建议预实验以EdU工作浓度为10μM进行摸索）；
2.2.以半换液的模式，将培养板中原细胞培养基吸除一半，并补加等体积预热的2×EdU孵育工作液，孵育一定的时间（孵育的时间一般取决于对应的细胞生长周期，通常占细胞周期10%左右的时间。对于大多贴壁且生长较快的细胞，建议孵育2 h左右。具体情况，需要随细胞特性、处理后实际情况等进行调整。如需孵育较长时间可适当降低EdU工作浓度；较短时间则可适当提高EdU浓度）；
2.3.将EdU标记孵育后的细胞样品，用PBS缓冲液清洗1-2次后，加入固定液，覆盖细胞即可，室温固定15 min（如需用流式检测，贴壁细胞此步之前先消化重悬后再固定，后续按悬浮细胞的处理方式即可）；用PBS缓冲液洗涤2-3次，每次3-5min；
2.4.去除PBS缓冲液，加入通透液，覆盖细胞或组织即可，室温孵育15min；
2.5.去除通透液后使用PBS缓冲液洗涤1-2次，每次3-5min，然后转至步骤4。
3.动物EdU注射造模以及组织切片处理：
3.1.根据实验要求，以腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、尾静脉注射等方式对动物进行一次或多次EdU注射造模，一般实验EdU用量和动物体重的比值为5mg/kg，具体注射量根据研究内容和动物情况而定。本试剂盒中提供部分EdU储存液，主要用于体外细胞EdU标记，如需对动物进行EdU造模，可单独订购EdU试剂；
3.2.小肠等上皮组织细胞增殖速度快，大脑等组织细胞增殖速度慢，生长较快的组织部位通常标记时间小于12小时，而生长较慢的组织标记时间可能需几天；最佳标记时间根据具体实验而定，由于小肠上皮组织增殖较快，建议取该类组织作为标记参考；
3.3.将造模动物按照规定标准处死后，取出所需的组织，按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片；
a.冰冻切片：放置恢复到室温，加入适量固定液，室温固定15min。去除固定液，用适量PBS缓冲液洗涤3次，每次3-5min；去除PBS缓冲液，用适量通透液，室温孵育10-15min；去除通透液，用PBS缓冲液洗涤1-2次，每次3-5min，然后转至步骤4。
b.石蜡切片：切片脱蜡复水，PBS洗涤5min。去除PBS缓冲液，加入通透液，覆盖细胞或组织即可，室温孵育15 min；去除通透液后使用PBS缓冲液洗涤1-2次，每次3-5min，然后转至步骤4。
4.EdU点击反应：
4.1.在细胞或组织固定和穿孔期间，配制点击反应液（对于不同样本配制体系参考以下表中方案）
对于体外培养细胞：本参考步骤是对应10个96孔板样品的体积用量（每孔100μL），可根据使用需求，等比例增加或减少配制量，请按下表顺序依次添加组分，边加边混匀（现配现用）；
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Component
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Volume
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反应缓冲液
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935μL
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催化试剂（试剂A）
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10μL
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荧光染料iF594（试剂B）
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5μL
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催化添加剂（试剂C）
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50μL
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总体积
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1000μL
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组织细胞切片：参考下体系进行点击反应液体系的配制，可根据切样本数，等比例增加或减小配制量，每个切片样本约用100-200 μL的点击反应液覆盖。
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Component
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Volume
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反应缓冲液
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928μL
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催化试剂（试剂A）
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10μL
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荧光染料iF594（试剂B）
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12μL
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催化添加剂（试剂C）
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50μL
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总体积
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1000μL
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4.2.去除上一步（步骤2.5或3.3）PBS缓冲液，加入点击反应液，轻摇保证反应液全部覆盖细胞或组织，室温避光孵育30min；
4.3.去除点击反应液，PBS缓冲液洗涤2-3次，每次3-5 min（如无其他特别要求，即可用流式细胞仪检测其荧光强度或用其他仪器检测荧光效果）。
5.细胞核染色：
5.1.去除上一步PBS缓冲液，将Hoechst 33342染色液与PBS缓冲液以1比500-1000比例稀释后，加入覆盖细胞，孵育5min；
5.2.去除Hoechst 33342染色液，PBS缓冲液洗涤2-3次，每次3-5min。
6.成像以及检测分析
直接将体外培养的细胞或者组织切片样品置于荧光显微镜或共聚焦显微镜等仪器检测，分析处于增殖的细胞占比；或者收集体外培养的细胞，用流式细胞仪检测荧光强度（建议使用未经EdU标记的细胞样品作为流式细胞仪检测的阴性对照，并选择合适的电压），根据荧光强度，来判断细胞周期中S期的DNA复制活性。本试剂盒荧光染料iF594（试剂B）对应的光谱特性为Ex/Em：593 nm/614 nm（红色）；Hoechst 33342染色液对应的光谱特性为Ex/Em：346 nm/460 nm（蓝色）。
注意事项
1.对于体外培养细胞，具体EdU使用浓度、孵育时间随样品以及研究目的的不同，可进行适当调整。
2.部分组织细胞增殖速度缓慢，为了排除造模效果不佳等因素，建议选增殖快的组织样品作为参照样本（如肠道组织）。
3.如果背景颜色过深，可能是实验中洗涤不充分、组织样品固定时间过长、固定液残余导致。
4.EdU催化添加试剂（试剂C）易氧化，尽量避免长时间暴露于空气中，配制成水溶液后，建议分装保存；经测试，如EdU催化添加试剂颜色发生轻微变化，点击反应催化体系依旧能够正常进行，如呈现棕色，表明该组分已失效，请弃用。
5.操作时请穿实验服，佩戴一次性手套。