qPCR 实验准备和操作全过程的经验
一、前期提前准备！
1. 实验仪器：移液枪、qPCR 仪要定期校准（较准周期一般是 1 年），保证仪器准确性。
2. 引物：引物设计后进行有效性验证，选取扩增效率在 90%～110% 之间，且融解曲线单峰的引物，保证其高效的扩增效率和特异性。
3. 内参：如何选择、如何验证？
选择：
（1）通过已发表文章查找相同物种的内参，在实验体系上进行测试；
（2）选择常见的内参，在实验体系上进行测试；
（3）内部控制基因（Internal Control Genes，ICG）库中查找内参。
验证：
（1）尽可能选用多个内参同时进行实验；
（2）通过在不同样本处理上的表达差异检测情况，来选择合适的内参，选择差异不显著的内参作为后续实验内参；
4. 样品 cDNA ：cDNA 模板需要稀释吗?应该稀释多少倍进行定量?
没有具体的稀释参考倍数，理论上 cDNA 每稀释 10 倍 CT 值变大 3.3，可以根据这个规律进行合适的稀释。可以使用 cDNA 原液、10 倍稀释液、100 倍稀释液等梯度稀释模板进行定量实验，根据规律选择 CT 值落在 18~28 范围内的稀释倍数。
二、提前排版 + 预混，准确加样不糊涂！
1. 实验目的：比较未处理（对照组）和经处理后（处理组）的样本中某基因的表达变化。
加样小 tips：
① 加样环境：qPCR 实验反应灵敏度高，所以配置预混液的过程应均在超净工作台中进行，防止污染；
② 配置条件：预混试剂在冰上操作，并避免强光直射，减少体系配置过程中导致模板降解、酶活降低以及荧光淬灭的可能；
③ 加样顺序：先加大体积，再加小体积液体；先加 NTC，再加模板。减小操作误差和污染风险；
④ 加样方式：
➣ 小体积加样可以采取移液器二档吸液一档出液（也就是说按到底吸液，出液的时候不要按到底），若不进行枪头更换，下个孔就是一档吸一档打，这样可以提高加样精确度和复孔的重复度；
➣ 如果离心管已有液体了，再加小体积的时候，把枪伸到液面下打，可以避免液体在枪头内残留；
➣ 吸液体的时候枪头不要没入液面下太深，并选低吸附枪头，减少枪头吸附引起的误差。